醬油是傳統發酵調味品，具有悠久的歷史，深受我 國、日韓和 東 南 亞 各 國 人 民 的 喜 愛。米 曲 霉 是 醬 油釀造中最重要的微生物，菌絲生長迅速，成熟后呈現 黃 綠 色 孢 子，具有優良的胞外酶系分泌和食品安全性，主 要 產 生 蛋 白 酶、淀 粉 酶、糖 化 酶、纖 維 素 酶 等。米曲霉蛋白酶根據酶切方式可分為內切酶和外切酶兩大類，其中內切酶包括中性、堿性、酸性蛋白酶， 外切酶包括羧肽酶和氨肽酶。

１ 材料與方法

１．１ 材料與試劑

１．１．１ 菌種

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ：本 實 驗 室 保 存，斜 面４ ℃保 藏。

１．１．２ 主要材料與試劑

馬鈴薯、麩皮、豆粕：市售，購于本地農貿市場。 葡萄糖、ＮａＣｌ、磷 酸 二 氫 鉀、磷 酸 氫 二 鉀、三 羥 甲 基氨基甲烷、ＨＣｌ：均 為 分 析 純，購自國藥集團化學試 劑有限責任公司；瓊脂：生化試劑，購自北京奧博星生 物技術有限責任公司；Ｌ－亮氨酸對硝基苯胺：分析純， 購自Ｓｉｇｍａ公司。

１．２ 儀器與設備

ＬＲＨ－２５０－２型恒溫培養箱上海博訊實業有限公司；ＨＶＥ－ＦＯ 型高壓蒸汽滅菌鍋 金壇市恒豐儀器 廠；ＳＷ－ＣＪ－２Ｆ型超 凈 工 作 臺 寧波新芝生物科技有 限公 司；ＰＬ４０３ 型 電 子 天 平 梅 特 勒－托 利 多 公 司； ３１１０型紫外－可見分光光度計 上海光譜儀器有限公 司；Ｂ－２６０型水浴鍋 上海醫療器械五廠。

１．３ 方法

１．３．１ 主要試劑的配制方法

磷酸緩沖液的制備（ｐＨ７．５）：使用電子天平準確 稱取磷酸 氫 二 鈉 ６．０２ｇ 和 磷 酸 二 氫 鈉 ０．５ｇ 加 入 １０００ｍＬ容量瓶中，然后加蒸餾水定容至１０００ｍＬ。

１．３．２ 培養基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（ＰＤＡ）的配制：將５００ｇ削 皮、干凈的土豆切碎置于１０００ｍＬ 大 燒 杯 中，補 充 蒸 餾水 至１０００ｍＬ，電爐加熱并維持煮沸狀態２０ｍｉｎ， ４層紗布過濾，用蒸餾水將濾液補充至１０００ｍＬ，加入 葡萄糖和瓊脂粉各２０ｇ煮沸直至全部溶解，分裝于三 角瓶中，于１２１ ℃滅菌２０ｍｉｎ。 麩皮豆粕培養基的制備：準確稱量豆粕２０ｇ、麩皮 ８０ｇ，添加１倍質量含不同鹽濃度的水混 勻。混 勻 后 分裝３０ｇ于２５０ｍＬ的三角瓶中，三角瓶中的鹽濃度 梯度為０、１％、３％、５％、７％（ｇ／ｄＬ），于１２１ ℃高壓蒸 汽滅菌２０ｍｉｎ，滅 菌 后 搖 瓶，保 持 原 料 處 于 疏 松 的狀態。

１．３．３ 菌種的培養

１．３．３．１ 斜面培養

將冰箱中４℃冷凍保藏的米曲霉菌種以無菌操作 的方式接種于新制備的 ＰＤＡ 斜面培養基上，于３０ ℃ 恒溫培養７２ｈ，備用。

１．３．３．２ 米曲霉的活化培養

將斜面上培養的成熟的米曲霉用接種環以無菌操 作方式接種于 ＰＤＡ 斜面培養基上，于３０ ℃恒溫培養 箱中培養７２ｈ。

１．３．３．３ 制備孢子懸液

取生長良好的試管斜面菌種，用磷酸鹽緩沖液輕 輕地將培養基上生長的米曲霉洗脫至裝有玻璃珠的 １５０ｍＬ無菌三角瓶中，震蕩２０ｍｉｎ 后用雙層紗布過 濾，然后使用血球計數板計數并 調整孢子濃度為 １０７ 個／ｍＬ。

１．３．３．４ 米曲霉的制曲培養

取適 量 孢 子 懸 液 以 無 菌 操 作 方 式 按 照 ３％ （ｍＬ／１００ｇ）的接種量接種于麩皮豆粕固體培養基上， 于３７ ℃培養７２ｈ。

１．３．４ 氨肽酶粗酶液的制備

取５ｇ于３７℃培養后的固體干曲，按照１∶２０（ｇ／ｍＬ） 加入０．１ｍｏｌ／ＬｐＨ 值為７．５的磷酸鹽緩沖液，于４０℃ 水浴中，間歇攪拌，浸提１ｈ，用４層紗布過濾后即可獲 得氨肽酶粗酶液。

１．３．５ 氨肽酶酶活力的測定

氨肽酶活力的測定采用亮氨酸對硝基苯胺法，以亮 氨酸氨肽酶酶活計。在 試 管 中 加 入２ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５的磷酸鹽緩沖液，然后向緩沖液中加入１ｍＬ經 過稀釋一定倍數的米曲霉氨肽酶粗酶液，最后向緩沖液 中加入１ｍＬ的 Ｌ－亮氨酸對硝基苯胺，輕輕搖晃試管使 其充分混合均勻，于５０℃水浴鍋中反應１０ｍｉｎ，立即取 出冰浴并于４０５ｎｍ處測量吸光值。 計算公式：Ｘ＝１０５．７×４×Ｎ×Ｙ／１００００。 式中：Ｘ為氨肽 酶 粗 酶 液 的 酶 活 力；Ｎ 為４０５ｎｍ 處測定得到的吸光值；Ｙ 為粗酶液的稀釋倍數。 氨肽酶酶活力的定義：將５０ ℃反應條件下，每分 鐘催化 Ｌ－亮氨酸－對硝基苯胺產生１μｍｏｌ對硝基苯 胺所需的酶量定義為１個酶活力單位（Ｕ）。

２ 結果與分析

在３７ ℃下將米曲霉在含有不同 ＮａＣｌ濃 度 （０、 １％、３％、５％、７％，ｇ／１００ｇ）的麩皮豆粕固體培養基上 進行培養，米曲霉生長情況見表１。

由表１可知，培養基中添加 ＮａＣｌ對米曲霉的生長有 一定的影響。在麩皮豆粕固體培養基中 ＮａＣｌ濃度由０ 增加到３％的過程中，米曲霉的生長速度隨著鹽濃度增加 而提高。在 ＮａＣｌ濃度為３％時，米曲霉培養７２ｈ出現大 量綠色孢子；而 ＮａＣｌ濃度為０時，需培養８４ｈ才有大量 綠色孢子產生，由此推測培養基中 ＮａＣｌ濃度為３％時，對 米曲霉的生長及產酶能力有一定程度的增強。當 ＮａＣｌ 濃度超過３％時，米曲霉生長又會變得緩慢，即當 ＮａＣｌ濃 度大于３％時，隨著鹽濃度的不斷升高，對米曲霉的生長 又表現出一定的抑制作用。

３ 結論

試驗結果表明，ＮａＣｌ對 米 曲 霉 的 生 長、米 曲 霉 產 氨肽酶能力以及米曲霉產氨肽酶活力都有一定影響。 在含有３％ ＮａＣｌ的培養基上培養，對米曲霉產氨肽酶 的能力有一定的促進作用，但在超過５％ ＮａＣｌ的培養 基上培養，對米曲霉產氨肽酶能力有明顯的抑制作用。 在磷酸鹽緩沖溶液中 ＮａＣｌ濃度為０～１０％時，隨著鹽 濃度的不斷 增 加，對氨肽酶活力有一定的促進作用， １０％時達到最高，培養７２ｈ酶活力為２６．２５８Ｕ／ｍＬ， 較未 添 加 ＮａＣｌ時酶活力提高了 ５．２９％，超 過 １０％ ＮａＣｌ濃度對氨肽酶活力有明顯抑制作用。但 經 過 在 含 ＮａＣｌ培養基 上 進 行 馴 化 培 養 后，米 曲 霉 氨 肽 酶 的 耐鹽性及活 力 都 得 到 一 定 的 提 升。３％ ＮａＣｌ濃 度 下 馴化培養后的米曲霉氨肽酶活力在１５％ ＮａＣｌ濃度環 境中最高，為２９．８８４Ｕ／ｍＬ，與未經 ＮａＣｌ馴化培養相 比較，米曲霉氨肽酶最大酶活力提高了１３．８１％，鹽濃 度提高了５％。


 

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