急 性 淋 巴 細 胞 白 血 病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種惡性血液系統腫瘤疾病， 也是兒童時期最常見的惡性腫瘤，占兒童惡性腫 瘤的 35%。ALL 的臨床癥狀主要表現為貧血、肝 脾腫大及免疫能力低下，對患者健康危害嚴重 。 ALL 的發病機理較為復雜，對其機理目前尚未完 全明確。

材料和方法

試劑及儀器

TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；胎牛血清購 自美國 Hyclone 公司；ECL 試劑盒購自武漢艾美 捷科技有限公司；增殖細胞核抗原（PCNA）、 Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9抗體均購自美國 Cell Signaling 公司；PVDF 膜購自美國密理博公司； 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶 科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上 海威奧生物科技有限公司；FACSCanto 流式細胞儀 購自美國 BD 公司；DYCZ-24A 型雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠；PCR 系統購自瑞士 Roche 公 司；超凈工作臺購自上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；CO2 細胞培養箱購自上海精密儀器儀表 有限公司。

臨床標本采集

2018 年 5 月至 2018 年 11 月在本院確診的 ALL 患 兒 23 例，其中男 14 例，女 9 例，年齡 8.9 ±2.3 歲， 參照張之南主編《血液病診斷及療效標準》進行 診斷。患兒家屬均簽署知情同意書，且本研究經 醫院倫理委員會批準。患兒的骨髓樣本均在治療 前采集，以防止藥物對骨髓樣本的干擾。采集患 兒骨髓樣本 2 m1 后，置于含 K2EDTA 的抗凝管中， 加入 Ficoll 分離液進行密度梯度離心，以提取骨髓 單個核細胞（BMNC），置于液氮保存。 細胞培養及轉染 采用含 10% 胎牛血清、5 μg/ml 青鏈霉素的 RPMI 1640 培養液，置于 37 ℃、5% CO2 的保溫箱培養， 每 2-3 d 傳代 1 次。

細胞轉染步驟

將 BMNC 接種 至 24 孔 板， 分 為 對 照 組（Control 組），miR-221 陰 性 對 照 組（miR-221-NC 組）及 miR-221 轉 染 組（miR-221 組），待細胞培養至對數期，按照 Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進行轉染操作， 并于 37 ℃、5% CO2 條件下培養。 ALL 細胞 miR-221 水平的 RT-PCR 檢測 各組細胞轉染后培養 24 h，采用 TRIzol 試劑盒提 取細胞總 RNA，檢測 RNA 純度后，通過逆轉錄試 劑盒合成 cDNA。按照 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒說明書檢測 miR-543 水平，以 U6 為內參，miR221 上 游 引 物：5′-CTGACTGCGTCACTGC-3′； 下 游 引 物：5′-CTGACGTGCAGTGCAC-3′。U6上游 引物：5′-GCGTACTGCGTGCATC-3′；下游引物： 5′-GACACTGCAGTCACTC-3′。PCR 反應步驟為： 95 ℃ 2 min；然后 95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s， 共 32 個循環，采用 2- △△ Ct 法計算基因的相對水平。 miR-221 對 ALL 細胞活力影響的 MTT 法檢測 將對數期細胞接種于 96 孔板，每孔 150 μl，細胞 密度為 3×105 /ml，每組均設置 3 個復孔，按照要 求轉染后培養 1、2、3、4 和 5 d，然后每孔加入 15 μl 的 MTT 試劑， 37 ℃條件下培養 2 h，棄培 養液后每孔加入 100 μl 的 DMSO，采用酶標儀在 490 nm 處檢測各孔 OD 值。 miR-221 對 ALL 細胞的細胞周期影響的流式細胞 術檢測 各組細胞轉染后培養 24 h，用 PBS 清洗 3 次后，經 70% 預冷的乙醇固定 12 h 后，制成密度為 1×105 /ml 的細胞懸液，加入 150 μl PI 染液避光孵育 30 min， 采用流式細胞儀檢測細胞周期分布。 miR-221 對 ALL 細胞凋亡影響的流式細胞術檢測 將對數期細胞接種在 6 孔板，按要求轉染后培養 24 h，經 1×binding buffer 清洗 3 次后，制成密度 為 1×105 /ml的細胞懸液，加入 5 μl Annexin V-FITC 避光孵育 10 min，清洗后用 500 μl 的 1×binding buffer 重懸細胞，加入 5 μl 的 PI 孵育 20 min 后上 機進行細胞凋亡檢測 ALL 細胞侵襲、遷移能力的 Transwell 檢測 首先在 Transwell 上室均勻鋪 100 μl 的 Matrigel 膠 （細胞遷移實驗無此步驟），然后將各組細胞接 種于 Transwell 上室，每孔加入 100 μl，細胞數為 1×105 /ml，下室加入 500 μl 10％胎牛血清的培養 液中培養 24 h，取出小室后用棉簽拭去小室上層 膜上未穿模的細胞，經 4% 的多聚甲醛固定 4 h 后， 采用 0.5% 結晶紫染色，經 PBS 洗滌 3 次后，在電 子顯微鏡下隨機選擇 5 個視野拍照并計數。蛋白表達水平的 Western blot 檢測 收集各組細胞后經 RIPA 裂解液處理提取總蛋白， 經 BCA 法檢測蛋白濃度。每孔上樣 15 μg 蛋白， 經 10% SDS-PAGE 電泳分離后，采用濕轉法將分 離的蛋白轉至 PVDF 膜，并采用 5% 脫脂奶粉室 溫下封閉 2 h，加入經稀釋的 PCNA、Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9 蛋 白 一 抗，4 ℃ 孵 育 過 夜， TBST 清洗 3 次后，加入 HRP 標記的二抗室溫孵育 2 h，使用 TBST 清洗 3 次后，經 ECL 試劑發光顯影， 拍照后采用 Quantity One 軟件分析條帶灰度值。 miR-221 靶向 Wnt 基因的熒光素酶報告基因實驗 檢測 利用 TargetScan 生物信息分析軟件預測 miR-221 與 Wnt 基因的結合片段，通過 PCR 技術將該片段擴 增后插入熒光素酶載體構建 Wnt 基因野生載體， 同時通過基因突變技術將該結合片段的部分核苷 酸隨機突變，用于構建 Wnt 基因突變載體。采用 脂質體轉染法將 miR-221 mimic 和 Wnt 基因野生載 體或 Wnt 基因突變載體共轉染 BMNC 細胞，每組 設置 3 復孔，置于 37 ℃、5% CO2 條件下培養 24 h， 按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書檢測熒光 素酶活性。 統計學分析 采用 SPSS 21.0 軟件處理數據，數據以均數 ± 標 準差表示，采用 t 檢驗分析數據，P＜ 0.05 示差異 有統計學意義。

結 果

轉染后各組 ALL細胞的 miR-221水平 miR-221 組的 miR-221 的表達水平顯著高于對照組 及 miR-221-NC 組（P＜ 0.05）（圖 1）。


討 論

ALL 是兒童時期較為常見的血液疾病，臨床癥狀 主要表現為免疫功能減弱、貧血、發熱及血小板 數量下降等 。在 ALL 治療過程中，由于需要長期的化療干預，往往會產生不良反應，對患兒健 康及生活也產生嚴重危害，有臨床研究發現，兒 童急性淋巴細胞白血病治愈率較低，且容易復發， 嚴重影響治療效果。有文獻報道，乳腺癌患者的腫瘤組織中 miR-221 水平顯著下降，這與患者預 后密切相關。miR-221 在肺癌、肝癌等多種癌細 胞中表達水平顯著下降，通過上調細胞中 miR-221 水平，可抑制癌細胞增殖及遷移。因此，需 進一步分析 miR-221 對 ALL 細胞抑制效果，以期 為提高患兒治療效果提供實驗參考。