土霉素( OTC) 是一種四環(huán)素類抗生素，能有效抑制致病微生物感染以及細(xì)菌生長繁殖，因其抗菌 性好、成本低，在醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。但長期使用抗生素會造 成其殘留量增多和在環(huán)境中的累積，增強(qiáng)細(xì)菌、病毒的耐藥性，易引發(fā)公共安全等問題。因此， 發(fā)展簡單、快速、靈敏、低成本的抗生素檢測方法對環(huán)境監(jiān)測、疾病預(yù)防具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1. 1 材料與儀器

石墨粉( 青島富潤達(dá)石墨有限公司) ; 土霉素( OTC) 、金霉素、四環(huán)素( 純度大于 98%，上海泰坦科技股 份有限公司) ; 鈦酸正丁酯( 分析純) 、90%( 脫乙酰基) 殼聚糖( Chitosan，CHIT) 、25%戊二醛( GA) 購自國藥 集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 三羥甲基氨基甲烷( 純度大于 99%) 、牛血清白蛋白( 純度大于 96%，BSA) 購自上 海麥克林生化科技有限公司; 氨基標(biāo)記的 OTC 適配體序列( 5-NH2-( CH2 ) 6-GGA ATT CGC TAG CAG GTT GAC GTT GAC GCT GGTGCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3) 由生工生 物工程( 上海) 股份有限公司合成。其它試劑均為市售分析純，實(shí)驗(yàn)用水為18. 2 MΩ·cm 的超純水。 CHI600D 電化學(xué)工作站( 北京華科普天科技責(zé)任有限公司) ; KQ5200V 超聲波清洗儀( 昆山市超聲 儀器有限公司) ; TGL － 20M 臺式高速冷凍離心機(jī)( 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司) ; 博迅GZX-9030MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱( 上海博迅實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠) ; DF － 101S 集熱式恒溫磁力攪拌器( 上海梅香儀器有 限公司) ; SU8010 日立高分辨場發(fā)射掃描電鏡( 日本株式會社公司) ; Nexus470 傅里葉變換紅外光譜儀 ( Nicolet 公司) ; HSX － F /UV300 氙燈光源( 北京紐比特科技有限公司) 。

1. 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1. 2. 1 土霉素溶液

稱取適量 OTC 用 PBS 緩沖液( 0. 1 mol /L KH2PO4 － 0. 1 mol /L Na2HPO4 ) 溶解定 容，配成 0. 01 mol /L OTC 溶液作為母液，于 － 20 ℃ 避光保存。所需不同濃度的 OTC 以此逐級稀釋， 于 4 ℃冰箱保存。

1. 2. 2 土霉素適配體( OTC － aptamer) 溶液

將所購 OTC － aptamer( 100 mmol /L NaCl，20 mmol /L Tris － HCl，5 mmol /L KCl，1 mmol /L CaCl2，2 mmol /L MgCl2 ) 的鏈序列 1 OD，在 12 000 r/m 下離心， 加入適當(dāng)體積緩沖液配成 100 μmol /L 的貯存液，于 － 20 ℃冰箱保存。用 Tris － HCl 緩沖液將貯存液稀 釋至 1. 5 μmol /L，于 4 ℃冰箱保存。使用前，在 95 ℃加熱 5 min 后進(jìn)行淬火，自然冷卻至室溫。

1. 3 傳感界面的構(gòu)建

1. 3. 1 氧化石墨的制備

采用常規(guī)的 Hummers 法制備氧化石墨: 在適量濃 H2 SO4、NaNO3 和石墨 粉存在下，緩慢加入 KMnO4，攪拌反應(yīng)一段時(shí)間后，加入一定量的 30% H2O2 除去未反應(yīng)的 KMnO4， 離心得到沉淀物，用 5% 稀鹽酸洗滌、離心多次，至濾液中不能檢出 SO2 － 4 ，將沉淀物放入透析袋中， 在水中透析至 pH 值接近中性。將產(chǎn)物放入 60 ℃烘箱中干燥，得到氧化石墨。

1. 3. 2 FTO 導(dǎo)電玻璃的清洗

將 FTO 導(dǎo)電玻璃依次在丙酮、無水乙醇和水中各超聲清洗 15 min 后， 在烘箱中烘干。

1. 3. 3 TiO2 /FTO 導(dǎo)電玻璃電極的制備( TiO2 /FTO)

先用水熱法制備納米 TiO2，即在 100 mL 燒杯 中加入 30 mL 水，再加入 30 mL 濃鹽酸，攪拌條件下緩慢加入 1 mL 鈦酸正丁酯，攪拌 30 min 后得到 混合液。量取適量混合液倒入反應(yīng)釜中，將烘干的 FTO 導(dǎo)電面朝下插入有混合液的反應(yīng)釜中，蓋緊， 放入160 ℃干燥箱中，反應(yīng)6 h。樣品自然冷卻后，用水清洗玻璃，再放入450 ℃馬弗爐中恒溫3 h 后， 即得到 TiO2 /FTO 導(dǎo)電玻璃電極。

1. 3. 4 TiO2 － 石墨烯/FTO 納米復(fù)合電極( TiO2 － rGO/FTO) 的制備

將 100 mg 氧化石墨分散于 300 mL 水中，超聲分散 2 h，得到氧化石墨烯( GO) ，并以此作為工作液; 用玻璃刀將 TiO2 /FTO 導(dǎo)電玻璃 切成 1 cm × 1 cm，以其作為工作電極，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用循環(huán)伏安法( 掃描范圍為 － 2. 5 ～ 2. 5 V，掃描速率為 50 mV·s － 1 ) 進(jìn)行電化學(xué)還原，經(jīng)適當(dāng)時(shí)間后，取出工作電極， 用水沖洗并吹干，即得到 TiO2 － rGO/FTO 納米復(fù)合電極。

1. 3. 5 土霉素適配體的固定化修飾

在 TiO2 － rGO/FTO 納米復(fù)合材料電極表面滴涂 90 μL 殼聚糖溶 液，在空氣中干燥過夜成膜，用水清洗吹干后，將 50 μL 稀釋的戊二醛溶液( 2. 5% ) 滴涂至修飾電極表 面，室溫下放置 1 h。清洗并干燥后，滴涂50 μL 1 μmol /L 的 OTC 適配體，在4 ℃冰箱中放置12 h 后， 用 PBS 緩沖液洗去未反應(yīng)的 OTC 適配體，滴加 50 μL BSA 在 37 ℃反應(yīng) 1 h，封閉殘留位點(diǎn)，經(jīng) PBS 緩 沖液沖洗后，即得到土霉素適配體修飾的 TiO2 /石墨烯復(fù)合材料電極( Aptamer/TiO2 － rGO/FTO) 。

1. 4 OTC 的檢測

將制備好的傳感界面( Aptamer/TiO2 － rGO/FTO) 與 50 μL 不同濃度 OTC 溶液( 0. 1 mol /L PBS，pH 7. 4) 在 60 ℃下反應(yīng) 1 h 后，用水清洗。采用 150 W 氙燈作為激發(fā)光源，在 CHI600D 電化學(xué)工作站( 三 電極體系，其中修飾電極為工作電極，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極) 上，選用安培電流時(shí) 間曲線法( 初始電位 － 0. 1 V，運(yùn)行時(shí)間 100 s) 記錄 OTC 反應(yīng)前后的光電流值，以光電流的變化值作為 與目標(biāo)物濃度對應(yīng)的信號值。

2 結(jié)果與討論

光電化學(xué)適體傳感器檢測土霉素的實(shí)驗(yàn)原理如圖 1 所示。實(shí)驗(yàn)采用 FTO 導(dǎo)電玻璃為基底，在其表 面制備了 TiO2 /石墨烯復(fù)合材料，通過滴涂殼聚糖溶液，使電極表面帶上氨基，通過戊二醛交聯(lián)，使氨 基標(biāo)記的土霉素適配體牢固地修飾至電極表面。采用電化學(xué)工作站檢測修飾了土霉素適配體的光電流， 此時(shí)得到的光電流為 I0。將修飾電極用于某一濃度的土霉素溶液測定時(shí)，土霉素與其適配體發(fā)生特異 性結(jié)合形成復(fù)合物，測得光電流值為 I。由于目標(biāo)物與適配體的特異性結(jié)合，阻礙了光電傳感界面對光 的有效吸收及光生電子的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致光電流減小，其信號值用 ΔI 表示，ΔI = I0 － I。基于電流的變 化值與待測物土霉素的濃度成正比，從而實(shí)現(xiàn)土霉素的測定。


3 結(jié) 論

在 FTO 先后用水熱法及電化學(xué)方法制備了納米 TiO2 /石墨烯光電傳感基底，比較了單一材 料及復(fù)合體系的光電化學(xué)性能。結(jié)合土霉素適配體對土霉素檢測的專一性與光電化學(xué)法的快速、經(jīng)濟(jì)、 簡單、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，成功構(gòu)建了一種性能優(yōu)良、穩(wěn)定性可靠、成本低、選擇性好的測定土霉素的光電 化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)了對水樣中微量土霉素的檢測。在優(yōu)化條件下，該傳感器的線性范圍為 5. 0 × 10 － 9 ～ 5. 0 × 10 － 6 nmol /L，檢出限為 1. 0 × 10 － 9 mol /L，有望用于實(shí)際樣品中微量土霉素殘留的測定。



 

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